Binimetinib通过死亡受体DR5诱导结肠癌细胞发生凋亡的机制研究

摘要

背景

结直肠癌(CRC)是世界范围内女性和男性中最常见的致命癌症。 2020 年， CRC 死亡率排名第二，发病率排名第三。 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 是一种丝裂原活化蛋白激酶 1/2（MEK1/2）抑制剂，目前处于Ⅲ期临床研究中。细胞凋亡是发生在大多数多细胞生物中高度调控的细胞死亡的正常生理过程。细胞凋亡主要有两种途径:外源性死亡受体途径和内源性线粒体凋亡途径。早期研究发现 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 通过内质网应激信号通路诱导结肠癌细胞发生凋亡，但是 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导细胞发生凋亡的具体机制有待进一步研究。

目的

探讨 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导结肠癌细胞发生凋亡的具体作用机制，验证 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 5-FU 、TRAIL 对结肠癌细胞的影响。为临床治疗结肠癌提供了新的治疗思路。

方法

1、使用不同浓度的 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 处理结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2，流式细胞术检测线粒体膜电位的改变

2、使用不同浓度的 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 处理结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2，WB 检测内源性凋亡途径中相关蛋白的表达改变。

3、使用不同浓度的 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 处理结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2，WB 检测凋亡蛋白 Cleaved caspase-8 表达量

4、使用 CCK8 检测 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 对 shcaspase-8 结肠癌细胞 HCT- 116、CaCo2 生长的影响。

5、使用 WB 检测 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导 shCaspase-8 结肠癌细胞中凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-8 、Cleaved caspase-3 表达情况。

6、使用不同浓度的 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 处理结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2，QPCR 检测死亡受体相关 RNA 的表达量。

7、使用不同浓度的 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 处理结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2，WB 检测诱导 DR5 蛋白的表达量。

8、干扰 DR5，使用 CCK8 检测 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 抑制结肠癌细胞 HCT- 116、CaCo2 生长的情况。

9、干扰 DR5，使用 WB 检测 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导结肠癌细胞 HCT- 116、CaCo2 中 DR5 、Cleaved caspase-8 、Cleaved caspase-3 蛋白的表达量。

10 、MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU，使用 CCK8 检测结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2 的生长情况。

11 、MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU，使用流式细胞术检测结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2 的凋亡率。

12 、MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU，使用 WB 检测结肠癌细胞凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-8 、Cleaved caspase-3 的表达情况。

13、构建裸鼠结肠癌皮下瘤， MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU 治疗裸鼠皮下瘤。

结果

1. 不同浓度 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 不能引起结肠癌 HCT- 116 、CaCo2 线粒体膜电位的改变

2. 不同浓度 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 不能诱导结肠癌细胞内源性凋亡途径中相关蛋白的表达改变。

3. MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导结肠癌细胞凋亡蛋白 Cleaved caspase-8 表达量增加

4. MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 抑制 shcaspase-8 结肠癌细胞生长的能力减弱。

5. MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导 shCaspase-8 结肠癌细胞中凋亡相关蛋白 Cleavedcaspase-8 、Cleaved caspase-3 能力减弱。

6. MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导死亡受体信号通过中 DR5 的 RNA 表达量增加。

7. MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导 DR5 蛋白表达量增加。

8. 干扰 DR5 ， MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 抑制结肠癌细胞生长的能力减弱。

9. 干扰 DR5 ， MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导结肠癌细胞中 DR5 、Cleavedcaspase-8 、Cleaved caspase-3 蛋白的能力减弱。

10. MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU 抑制了结肠癌细胞 HCT-116 、CaCo2 存活。

11. MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU 诱导结肠癌细胞 HCT-116 、CaCo2 凋亡率增加。

12.MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU 诱导结肠癌细胞凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-8 、Cleaved caspase-3 表达增加。

13.MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU 抑制了裸鼠皮下瘤的生长。

结论

MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 不通过线粒体途径诱导结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2凋亡。 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 通过死亡受体 DR5 来诱导结肠癌细胞 HCT- 116、CaCo2 凋亡。 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 5-FU 、TRAIL 抑制结肠癌细胞生长的能力增强，诱导结肠癌细胞发生凋亡的能力增强。体外功能试验验证了 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 分别联合化疗药 5-FU 、TRAIL 抑制了裸鼠的皮下瘤生长。为临床治疗结肠癌提供了新的治疗思路。

关键词： 结肠癌； Binimetinib；死亡受体凋亡；

前言

结肠癌是消化道常见肿瘤之一，发现较早一般预后较好，但是，由于没有很好的预防措施和早期发现的手段，在过去的 25 年里，在 50 岁以下的年轻人中，结直肠癌的发病率和死亡率一直在上升[1] 。虽然采用结肠镜筛查方案降低了 CRC 的发病率和死亡率，但结肠癌仍是所有癌症中第二大癌症相关死亡原因，在所有 CRC 患者中， 20-25%的患者有转移性疾病[2]。

MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 是一种丝裂原活化蛋白激酶 1/2（MEK1/2）抑制剂，目前处于Ⅲ期临床研究中[3] 。目前 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 主要用在治疗黑素瘤[4] 、白血病[5] 、胆道癌[6] 、非小细胞肺癌[7]和 BRAFV600E 突变转移性结直肠癌[8] 。目前MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 在我国并未上市，在国外进行多项临床试验，从而验证其治疗癌症的效果。虽然有报道显示 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 抑制了 BRAFV600E 突变转移性结直肠癌结肠癌生长，但是 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 抑制结肠癌细胞生长的具体作用机制还不是很清楚。

细胞凋亡是发生在大多数多细胞生物中受体内基因精准调控的细胞程序化死亡过程 [9] 。细胞凋亡主要有两种途径:外源性死亡受体途径和内源性线粒体凋亡途径。外部途径是指由配体和受体激活的死亡受体途径。多种介质，包括 TNFa, Fas 配体， TRAIL 和TLIA。配体 TRAIL 被 TNFa 等因子激活，促凋亡介质与各自的受体结合，催化多个Caspase8 的活化，进而导致 Caspase3 的活化和促凋亡[10,11] 。内部途径也被称为线粒体途径。当线粒体结构被外界刺激如缺氧、辐射和细胞毒素破坏时， MPTP 打开。随着促凋亡因子进入细胞质， Bcl-2 家族激活促凋亡因子[12,13] 。Bax 是与抗凋亡蛋白 Bcl-2 相对应的 Bcl-2 家族成员，在内外因素的作用下， Bax 定位于线粒体外膜，引起处于线粒体内外膜之间的细胞色素 C（Cytochrome C）的释放，在 ATP/dATP 的协同作用下，Cytochrome C 进入细胞质与 Apaf-1 结合形成寡聚体，激活 caspase-9 及其下游 caspase-3，导致细胞凋亡[14]。前期我们课题研究发现， MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 可以通过内质网应激信号通路诱导结肠癌细胞发生，但是诱导结肠癌细胞发生凋亡的具体机制还不是很清楚。

材料与方法

1 实验材料

1.1 主要试剂

试剂名称	生产厂家
高糖培养基（DMEM）	Gibco，美国
胎牛血清（FBS）	Gibco，美国
PBS	Hyclone，美国
胰酶	Hyclone，美国
青霉素-链霉素双抗	碧云天生物技术有限公司，中国
兔抗、鼠抗	Proteintech，美国
Bcl-2 、Bax 、Cytochrome-C 抗体	CST，美国
cleaved caspase-3 、8 抗体	CST，美国
DR5 抗体	Abways Technology，美国
Tubulin	Abways Technology，美国
MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 、5-FU 、Trail	MCE，美国
BCA 蛋白定量试剂盒	碧云天生物技术有限公司，中国
ECL 显影液	Thermo Fisher Scientific，美国
CCK8 试剂	MCE，美国
All-in-One™ miRNA RT-PCR 检测试剂盒	成都耶达科技有限公司，中国
PCR 逆转录试剂盒	诺唯赞生物科技有限公司，中国
凋亡试剂检测盒	同仁，日本
Trizol 试剂	Thermo 公司，美国
RIPA 试剂	碧云天生物技术有限公司，中国
PMSF 试剂	碧云天生物技术有限公司，中国
Lipo8000TM 转染试剂	碧云天生物技术有限公司，中国

1.2 主要仪器

仪器名称

CO2 细胞培养箱

超净工作台

流式细胞仪

制冰机

离心机

超纯水仪

电子天平

移液器

高压蒸汽灭菌器

电子显微镜

荧光显微镜

WB 直电泳槽、电转槽

多功能酶标仪

离心机

计数板

生产厂家

Thermo 公司，美国

Thermo 公司，美国

T Thermo 公司，美国

济南博华仪器有限公司，中国

Thermo 公司，美国

东莞市杰邦水处理有限公司，中国

济南博华仪器有限公司，中国

Thermo 公司，美国

济南爱环医疗器械有限公司，中国

Nikon，日本

Olympus ，日本

Bio-red，美国

Thermo 公司，美国

Thermo 公司，美国

Marienfeld，德国

1.3 引物序列

GAPDH	Forward	5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'
GAPDH	Reverse	5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'
DCR1	Forward	5'-CCTTCTTGCTTCCCATGTAC-3'
DCR1	Reverse	5'-CTTCAACACACTGGATATCATC-3'
DCR2	Forward	5'-TCATGTCCTTCACGAGTTCC-3'
DCR2	Reverse	5'-CTCTGACACCCTTCAGCTTC-3'
DCR3	Forward	5'-CCTCAATGTGCCAGGCTCTT-3'
DCR3	Reverse	5'-ATGACGGCACGCTCACACT-3'

DR4	Forward	5'-CTCGCTGTCCACTTTCGTCTC-3'
DR4	Reverse	5'-GTACCAGCTCTGACCACATC-3'
DR5	Forward	5'-AAGACCCTTGTGCTCGTTGT-3’
DR5	Reverse	5'-AGGTGGACACAATCCCTCTG-3’
TRAIL	Forward	5'-GAGCTGAAGCAGATGCAGGAC-3'
TRAIL	Reverse	5'-TGACGGAGTTGCCACTTGACT-3'
FAS	Forward	5'-TGTAGATTGTGTGATGAAGG-3'
FAS	Reverse	5'-GATTCCATGTTCACATTTGG-3'
TNFR1	Forward	5'-TGTGCACCTGCCATGCAGG-3'
TNFR1	Reverse	5'-CAGCACTGTGGTGCCTGAG-3'
TNFR2	Forward	5'-GCCCCACCAGATCTGTAACGTG-3'
TNFR2	Reverse	5'-TGAGGCACCTTGGCTTCTCTC-3'

2、实验方法

........略

3.3 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU 诱导结肠癌细胞凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-8 、Cleaved caspase-3 表达增加

我在 CCK8 及流式检测凋亡的基础上利用 WB 研究了 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib联合化疗药 TRAIL 、5-FU 对结肠癌细胞凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-8 、Cleavedcaspase-3 表达的影响。结果图 12 显示，经过 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 分别联合化疗药 TRAIL 、5-FU 处理结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2 细胞后，与对照组和单独用药组相比，联合组凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-8 、Cleaved caspase-3 表达增加，对蛋白条带进行灰度分析，差异有统计学意义*r＜0.05。

图 12 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU 诱导结肠癌细胞凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-8 、Cleaved caspase-3 表达的影响

3.4 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 联合化疗药 TRAIL 、5-FU 抑制了裸鼠皮下瘤的生长

最后，我在裸鼠上进行体外功能试验，验证 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 分别联合化疗药 TRAIL 、5-FU 对裸鼠皮下瘤生长的影响。结果图 13 显示，给予 5-FU 、TRAIL 、 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 、MEK1/2 抑制剂 Binimetinib+5-FU 、MEK1/2 抑制剂 Binimetinib+TRAIL 后，裸鼠皮下的生长受到了抑制。治疗周期结束后，取裸鼠肿瘤称重，对肿瘤体重进行统计学分析，与单独用药组相比较，差异有统计学意义**r＜0.01。

讨论

结直肠癌(CRC)是世界范围内女性和男性中最常见的致命癌症。 2020 年， CRC 死亡率排名第二，发病率排名第三[1]。由于没有临床症状，早期诊断 CRC 比较困难。尽管分子生物学有了进展，但只有有限数量的生物标志物被转化为常规临床实践，以预测风险、预后和对治疗的反应[18] 。在过去的几十年里，组学水平的系统生物学方法变得越来越重要。多年来，在疾病诊断和预后方面，已经发现了一些 CRC 的生物标志物。另一方面，一些药物正在开发和用于临床治疗结直肠癌。然而，新药物的研发成本高昂，耗时长久，
研发费时约十年，费用超过十亿元。
MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 是一种丝裂原活化蛋白激酶 1/2（MEK1/2）抑制剂，目前处于Ⅲ期临床研究中[3] 。目前 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 主要用在治疗黑素瘤[4] 、白血病[5]、胆道癌[6]、非小细胞肺癌[7]和 BRAFV600E 突变转移性结直肠癌[8]。目前 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 在我国并未上市，在国外进行多项临床试验，从而验证其治疗癌症的效果。我们课题组早期研究发现， MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 可以诱导结肠癌细胞发生凋亡，而且可以通过内质网应激信号通过中 PERK-p-eIf-2a-CHOP 信号通路诱导结肠癌细胞发生凋亡[19]，但是 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导结肠癌细胞发生凋亡的具体原因还
不是很清楚。
细胞凋亡是发生在大多数多细胞生物中受体内凋亡相关基因调控的程序化细胞死亡过程 [9] 。细胞凋亡受体内外多种因素的调控，细胞内多种信号通路参与了凋亡的调控，包括内源性的线粒体和内质网凋亡通路，外源性的死亡受体相关通路，其中线粒体凋亡信号通路最为常见。线粒体凋亡信号通路在包括 Bcl-2 家族蛋白等调控下，线粒体膜通透性增加，处于内外膜之间的细胞色素 C 释放到胞质中，引起细胞凋亡发生的级联反应 [15]。所以，我们首先检测了不同浓度 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 对结肠癌 HCT- 116、CaCo2 线粒体膜电位及线粒体凋亡相关蛋白的影响。结果显示虽然经过不同浓度的 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 处理结肠癌 HCT- 116 、CaCo2 后，线粒体膜电位并未发明明显的改变，而且线粒体凋亡相关蛋白表达量也未见明显改变，说明 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 不能
通过内源性凋亡途径诱导结肠癌细胞发生凋亡。

22

凋亡的发生主要由 Caspase 家族蛋白引起。哺乳动物细胞内 Caspase 家族蛋白通过线粒体和非依赖线粒体（死亡受体信号通过）的信号通路诱导细胞凋亡。在 Caspase 蛋白家族中，依据在凋亡中发挥作用的不同将 Caspase 蛋白家族分为起始 Caspase 和效应 Caspase 两个亚型，而 Caspase-8 是起始 Caspase。Caspase-8 是死亡受体信号通路诱导细胞凋亡中重要的蛋白[16] ，而且 Caspase-8 是是外源性细胞凋亡启动死亡受体信号通路中的启动子，接下来我们又检测了 Cleaved caspase-8 蛋白表达情况。结果发现， MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导了 Cleaved caspase-8 蛋白表达，并且通过 Cleaved caspase-8 抑制了
结肠癌细胞的增殖，促进了结肠癌细胞的凋亡。
TRAIL 是 TNF 超家族的成员。 TRAIL 及其受体诱导的凋亡信号传递途径以选择性促进肿瘤细胞凋亡为特征[20,21] 。TRAIL 及其受体诱导细胞凋亡的机制如下:DR4 和 DR5 是含有死亡域(death domains, DD)的功能性受体。当与 TRAIL 结合时，向细胞传递凋亡信号。FADDC 端上的 DD 然后与 DR4/DR5 上的 DD 相互作用。FADD 的 N 端也含有一个 DD，它介导细胞凋亡的信号传递。当 DD 与 procaspase 8 上的死亡效应域结合时， TRAIL DR4/DR5 FADD procaspase-8/ 死亡诱导信号复合物(DISC) 形成。 DISC 中的 procaspase 8 切割自身产生有活性的 caspase 8，激活两条凋亡信号通路。在第一种途径中， caspase 8 直接激活 caspase 3 、6 和 7，通过 DR 途径诱导凋亡[22,23] 。在第二种途径中，
caspase-8 通过激活 Bid 与线粒体连接，进而通过线粒体诱导凋亡[24,25]。
然后又以外源性凋亡途径为切入点研究。死亡受体信号通路通过三条途径诱导细胞凋亡。三条信号通过包括： TNF 途径、 TRAIL 途径、 FAS/FASL 途径。死亡受体包括： DCR1、DCR2、DCR3、TNF1、TNF2、FAS、TRAIL、DR4、DR5[17]。接下来，我们使用不同浓度的 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 处理结肠癌细胞 HCT- 116 、CaCo2，使用 Q-PCR 检测了结肠癌细胞中死亡受体 RNA 的表达情况。结果显示，经过不同浓度 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 处理结肠癌细胞 HCT- 116、CaCo2 后，两个细胞株内 DR5 的 RNA 表达量增加，然后又检测 DR5 蛋白的标量，结果显示， MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 可以诱导 DR5 蛋白表达量增高。干扰掉 DR5 后，MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 抑制结肠癌细胞增殖
的能力减弱，同时 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 诱导结肠癌细胞发生凋亡的能力减弱。进

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一步说明了， MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 通过死亡受体 DR5 诱导了结肠癌细胞发生了凋
亡。
随后我们又研究了使用 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 分别联合化疗药 5-FU 、TRAIL 对结肠癌细胞的影响。结果提示MEK1/2 抑制剂Binimetinib 分别联合化疗药 5-FU、TRAIL 抑制结肠癌细胞生长的能力增强，诱导结肠癌细胞发生凋亡的能力增强。体外功能试验验证了 MEK1/2 抑制剂 Binimetinib 分别联合化疗药 5-FU 、TRAIL 抑制了裸鼠的皮下瘤
生长。为临床治疗结肠癌提供了新的治疗思路。

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