摘 要
目的 本研究检测环状RNA(circRNA，circ_0000337)在宫颈癌组织中的表达水平，分析其与宫颈癌患者临床特征之间的关系，同时，深入探讨circ_000037在宫颈癌(cervical cancer，CC)中的生物学功能，探讨其在宫颈癌发生发展中的潜在作用机制。
方法 应用生物信息学方法预测circ_0000337和miR-155-5p的表达靶点，分析其在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的基因表达差异；采用Western blot和实时定量聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 检测circ_0000337、miR-155-5p和Ras癌基因家族成员RAB3B的蛋白和/或mRNA表达水平。根据收集的临床资料分析circ_0000337与宫颈癌患者临床特征之间的关系。通过细胞培养，建立过表达/敲减circ_0000337模型后，通过CCK-8实验评估宫颈癌细胞增殖能力。通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因分析和RNA免疫沉淀法（RIP）鉴定circ_0000337、miR-155-5p和RAB3B之间的相互作用。
结果 （1）通过与癌旁正常宫颈组织比较，发现circ_0000337在宫颈癌组织中的mRNA表达水平明显上调（P < 0.01），同时通过分析circ_0000337表达与宫颈癌患者临床特征之间的关系发现，circ_0000337表达与宫颈癌患者的年龄及HPV感染无关（P > 0.05），与肿瘤直径大小、肿瘤组织分化程度密切相关（P< 0.01）。
1. 通过与正常宫颈上皮细胞H8细胞比较，发现circ_0000337在宫颈癌细胞系SiHa和C33A细胞中的mRNA表达明显上调（P < 0.01）。CCK-8实验发现circ_0000337过表达可明显促进宫颈癌细胞的增殖（P<0.01），circ_0000337敲减可显著抑制宫颈癌细胞的增殖（P < 0.01），提示circ_0000337在宫颈癌细胞增殖过程中发挥重要作用。
2. ENCORI数据库预测circ_0000337的靶向miRNA为miR-155-5p；双荧光素酶报告基因检测实验发现miR-155-5p mimic可显著抑制宫颈癌细胞中野生型circ_0000337的荧光素酶活性（P <0.01），对突变型circ_0000337的荧光素酶活性影响不大（P>0.05）；RIP实验显示circ_0000337和miR-155-5p在含有Ago2的微核糖核蛋白中富集，证实了circ_0000337靶向调控miR-155-5p。
3. miR-155-5p在宫颈癌细胞及宫颈癌组织中表达水平均明显下降（P<0.01），通过Pearson相关分析进一步认识到宫颈癌组织中circ_0000337与miR-155-5p之间表达呈负相关（P<0.01）。
4. circ_0000337过表达诱导的miR-155-5p表达下调可被miR-155-5p mimic逆转，而circ_0000337敲减导致的miR-155-5p表达上调可被miR-155-5p inhibitor降低；同时，CCK-8实验发现circ_0000337过表达导致的宫颈癌C33A细胞增殖能力增强可被miR-155-5p mimic减弱，而circ_0000337敲减诱导的HeLa细胞增殖能力减弱可被miR-155-5p inhibitor 逆转，提示circ_0000337通过海绵吸附miR-155-5p促进宫颈癌细胞的增殖。
5. TargetScan V7.2软件预测miR-155-5p的靶基因为RAB3B；双荧光素酶报告基因检测实验验证了miR-155-5p与RAB3B之间的靶向关系；Western blot检测发现circ_0000337过表达可增强宫颈癌细胞C33A中RAB3B表达，但当给予miR-155-5p mimic干预后，RAB3B的表达上调可被miR-155-5p mimic减弱；circ_0000337敲减后可明显减弱HeLa细胞中RAB3B表达，而这种减弱效果可被miR-155-5p inhibitor逆转，提示circ_0000337通过靶向miR-155-5p上调RAB3B表达。
6. 通过GEPIA数据库发现宫颈癌组织中RAB3B的表达明显上调；qRT-PCR检测发现RAB3B mRNA表达在宫颈癌细胞及宫颈癌组织中均明显上调；通过Pearson相关分析发现，宫颈癌组织中RAB3B与circ_0000337表达水平呈正相关，与miR-155-5p mRNA表达水平呈负相关。
7. UALCAN数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库显示miR-155-5p高表达与宫颈癌患者总生存期（overall survival，OS）延长密切相关；Kaplan-Meier Plotter数据库、GEPIA 数据库和ENCORI软件显示RAB3B低表达与宫颈癌患者OS延长密切相关。ENCORI软件进一步显示宫颈癌组织中RAB3B与miR-155-5p表达呈负相关。
结论 （1）在宫颈癌细胞系与组织中，circ_0000337和RAB3B的表达上调，miR-155-5p的表达下调。
1. circ_0000337过表达促进细胞增殖，circ_0000337敲减通过吸附miR-155-5p抑制细胞增殖。
2. RAB3B是受circ_0000337正向调控的miR-155-5p的靶标。
3. 在宫颈癌组织中，miR-155-5p与circ_0000337、RAB3B呈负相关，而circ_0000337与RAB3B呈正相关。
4. 宫颈癌患者miR-155-5p与OS呈正相关，RAB3B与OS呈负相关。
5. circ_0000337通过海绵吸附miR-155-5p上调RAB3B，进而促进宫颈癌细胞增殖。
关键词：宫颈癌，circ_0000337，miR-155-5p，RAB3B，总生存期
第一章 绪 论
1.1课题来源、研究的目的和意义
宫颈恶性肿瘤是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率一直很高[2]，且近年来呈现出年轻化趋势。尽管因为广泛的HPV疫苗接种和早期筛查项目的实施，在宫颈癌的治疗和预防方面取得了一定的进展，但仍然面临着诸多挑战[3]。一方面，部分患者因治疗方案的限制或耐药性导致治疗效果不佳，另一方面，一些宫颈癌患者在诊断时已处于晚期，限制了治疗效果和生存率[4]。宫颈癌的发病机制至今仍未完全阐明，尤其是在分子水平上的细节仍然不清楚[5]。因此，深入研究宫颈癌的发病机制、寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义。
近年来，随着RNA研究的深入和技术的发展，环状RNA（circRNA）作为一类在真核细胞中广泛存在的非编码RNA，引起了学术界的广泛关注[6]。circRNA具有闭合的环形结构，与线性mRNA相比具有更高的稳定性和抗降解能力[7]。越来越多的研究显示，circRNA在多种生物学过程中发挥着极其重要的调控作用，包括但不限于调控基因表达、细胞增殖、转移和凋亡等[8]。在宫颈癌这一重大的女性恶性肿瘤中，circRNA的研究尚处于起步阶段，但已经展现出了巨大的潜力[9]。一方面，一些初步的研究表明，circRNA在宫颈癌的发生发展中可能发挥着重要的调控作用，可能涉及到调节关键基因的表达、细胞信号通路的调控等方面[10]。另一方面，一些circRNA在宫颈癌中的表达异常与患者的临床特征及预后密切相关，提示circRNA可能成为宫颈癌诊断、治疗和预后评估的潜在生物标志物[11]。然而，目前关于circRNA在宫颈癌中的生物学功能和分子机制的研究还相对有限。更深入的研究将有助于全面理解circRNA在宫颈癌中的作用机制，为宫颈癌的精准诊断、个性化治疗和预后评估提供更多的科学依据和临床应用价值。因此，对circRNA在宫颈癌中的研究具有重要的意义和价值[12]。
有些前人的研究发现circ_0000337在宫颈癌、食管鳞状细胞癌、骨肉瘤、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤中有差异性表达，基于导师课题组前期的研究基础，本研究选择了circ_0000337作为主要分子。本研究旨在探讨circ_0000337在宫颈癌中的生物学功能，通过一系列实验和分析方法，深入研究其调控机制。具体而言，本研究包括以下方面的内容：生物信息学分析预测circ_0000337可能的靶向miRNA和miRNA靶向的mRNA。通过生物信息学工具对circ_0000337的序列进行分析，预测其与miRNA的结合位点，并进一步预测miRNA靶向的mRNA，为后续实验设计提供了理论基础。应用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot等实验方法，检测了circ_0000337、miR-155-5p和RAB3B在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达水平。通过这些实验手段，验证了生物信息学分析的预测结果，并确定了宫颈癌中这些分子的表达模式。通过建立circ_0000337过表达或敲降模型，利用细胞增殖实验评估circ_0000337对宫颈癌细胞增殖的影响。通过调控circ_0000337的表达水平，观察宫颈癌细胞增殖的变化，进一步验证了circ_0000337在宫颈癌中的生物学功能。运用生物信息学分析预测，同时结合双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀（RIP）等实验方法，鉴定了circ_0000337、miR-155-5p和RAB3B之间的相互作用。通过这些实验手段，揭示了circ_0000337通过调控miRNA和其靶向基因的表达，参与了宫颈癌细胞增殖调控网络的调控机制。综上所述，本研究通过多种实验手段和分析方法，全面探讨了circ_0000337在宫颈癌中的生物学功能及其调控机制，为深入理解宫颈癌的发病机制提供了重要的理论和实验基础。
1.2 国内外研究概况
1.2.1 国外研究概况
首先，国外研究在宫颈癌的发病机制方面取得了重要进展。通过对宫颈癌相关的遗传变异、表观遗传学调控、信号通路活性等方面的研究，揭示了多种调控因子在宫颈癌发生发展过程中的作用机制，为宫颈癌的预防和治疗提供了理论基础[13]。其次，在宫颈癌的早期诊断和筛查方面，国外研究也开展了大量工作。包括人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）感染的分子检测、细胞学检查、生物标志物筛查等多种方法在宫颈癌早期诊断中的应用，为提高宫颈癌的早期诊断率和治疗效果提供了技术支持[14]。此外，在宫颈癌的治疗方面，国外研究涉及到手术治疗、放射治疗、化学治疗、靶向治疗等多种治疗手段的探索和应用。针对不同分期和病情的宫颈癌患者，制定个体化的治疗方案，提高了治疗效果和生存率[15]。
总的来说，国外在宫颈癌研究领域的积极探索和深入研究，为我们深入理解宫颈癌的发病机制、提高早期诊断率和治疗效果提供了重要的参考和借鉴。同时，也为我国相关领域的研究和临床实践提供了宝贵的经验和启示。
1.2.2 国内研究概况
宫颈癌在我国女性中的发病率仅次于乳腺癌，这一现象引起了国内学术界的广泛关注。国内在宫颈癌研究领域积极开展了一系列的基础与临床研究，取得了一定的成果。
首先，在宫颈癌的流行病学调查方面，国内学者通过对宫颈癌患者的人口学特征、疫苗接种情况、病毒感染率等进行调查分析，揭示了我国宫颈癌的发病规律和高危人群，为宫颈癌的预防和控制提供了重要的参考依据[16]。其次，在宫颈癌的早期筛查和诊断方面，国内开展了一系列的研究工作。包括利用HPV病毒检测、液基细胞学检查、阴道镜检查等多种方法对宫颈癌进行早期筛查和诊断，提高了宫颈癌的早期发现率和治疗效果[17]。此外，在宫颈癌的治疗方面，国内也进行了一些研究探索。包括手术治疗、放射治疗、化学治疗等多种治疗手段的应用和疗效评价，为我国宫颈癌患者制定了个体化的治疗方案[18]。
总的来说，国内在宫颈癌研究领域的努力和探索，为我国宫颈癌的预防、早期诊断和治疗提供了一定的技术和理论支持。但与国外相比，国内在宫颈癌研究领域还存在一定的差距，需要加强多学科合作，深入开展基础与临床研究，提高我国宫颈癌防治水平，保障女性健康。
第五章 结 论
1.在宫颈癌组织和细胞系中，环状RNA circ_0000337的表达水平显著上调，而miR-155-5p的表达水平明显下调，提示circ_0000337可能在宫颈癌中发挥重要作用。
2.实验结果表明，circ_0000337过表达促进了宫颈癌细胞的增殖，而circ_0000337沉默则抑制了细胞增殖，进一步证实circ_0000337在宫颈癌中的促癌作用。
3.通过生物信息学分析和实验验证，我们发现miR-155-5p是circ_0000337的潜在靶向miRNA，并进一步证实miR-155-5p可以抑制RAB3B的表达。
4.RAB3B被确认为miR-155-5p的靶向基因，间接且正向地受circ_0000337调控，进一步揭示了circ_0000337通过海绵吸附miR-155-5p上调RAB3B，从而在宫颈癌细胞增殖中发挥重要作用。
5.在临床样本中，circ_0000337与miR-155-5p之间存在负相关，miR-155-5p与RAB3B之间存在负相关，circ_0000337与RAB3B之间存在正相关，这进一步支持了我们的实验结果。
参考文献 略
