摘要：玉米赤霉烯酮（Zearalenone ，ZEN）是一种通过侵染谷物威胁食品安全的重要真菌毒素，开发一种快速而灵敏的ZEN检测方法对于有效避免ZEN危害具有重要意义。本文构建了基于Genefinder核酸染料的荧光传感体系，利用Genefinder结合双链DNA产生荧光增强的特性，实现食品中ZEN的快速检测。ZEN适配体与其互补链形成双链结构，Genefinder与双链DNA结合后荧光信号可显著增强，最大吸收峰为530 nm，加入ZEN后，适配体与ZEN结合，双链打开，互补链释放到溶液中，荧光强度减弱。实验结果表明，该方法的线性范围为0.1-500μg /kg，检测限为0.1ng/mL，并且该传感体系对ZEN具有较高的选择性。
关键词：玉米赤霉烯酮；Gennefinfer；核酸适配体；荧光传感体系
Abstract: Zearalenone (ZEN) is an important fungal toxin that threatens human. The development of a rapid and sensitive ZEN detection method is of great significance to effectively avoid the harm of ZEN. In this paper, a fluorescence sensing system based on Genefinder is constructed for rapid detection of ZEN in food. The fluorescence is increased due to the interaction bewtween Genefinder and double-strand DNA. The double-strand DNA was formed by ZEN aptamer bound with its complementary strand. After bound with Genefinder, the fluorescence signal could be significantly enhanced, with a maximum emission peak of 530 nm. After adding ZEN, the aptamer bond to ZEN, the double-strand was opened, and the complementary strand is released into the solution, the fluorescence intensity decreased. The experimental results showed that the linear range of the method was 0.1-1000ug / kg, the detection limit is 0.1 ng / mL, and the sensing system has high selectivity for ZEN.
Key word: Zearalenone; Genefinder; Aptamer; Fluorescence sensing system
关键词：玉米赤霉烯酮；Gennefinfer；核酸适配体；荧光传感体系
Abstract: Zearalenone (ZEN) is an important fungal toxin that threatens human. The development of a rapid and sensitive ZEN detection method is of great significance to effectively avoid the harm of ZEN. In this paper, a fluorescence sensing system based on Genefinder is constructed for rapid detection of ZEN in food. The fluorescence is increased due to the interaction bewtween Genefinder and double-strand DNA. The double-strand DNA was formed by ZEN aptamer bound with its complementary strand. After bound with Genefinder, the fluorescence signal could be significantly enhanced, with a maximum emission peak of 530 nm. After adding ZEN, the aptamer bond to ZEN, the double-strand was opened, and the complementary strand is released into the solution, the fluorescence intensity decreased. The experimental results showed that the linear range of the method was 0.1-1000ug / kg, the detection limit is 0.1 ng / mL, and the sensing system has high selectivity for ZEN.
Key word: Zearalenone; Genefinder; Aptamer; Fluorescence sensing system
1 文献综述
1.1 ZEN简介
ZEN（Zearalenone，ZEN）最初由Stob等人从感染镰刀菌的玉米植株中分离而来，由于其主要产毒菌株为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），因此又称为F-2毒素[1]。其本质是一种酚的二羟基苯甲酸内酯化合物，分子式为C18H22O5，具有12个化学衍生物，分子质量为318，熔点160℃以上，在碱性条件下可以将酯键打开[2]。ZEN不溶于水、二硫化碳和四氧化碳，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和酸类，微溶于石油醚[2]。
1.2 ZEN的危害
ZEN的主要侵染对象为谷物等农作物，如小麦，燕麦，大米，花生等常见农作物。但是在众多侵染对象中，玉米占据绝大部分，约占45%左右，其次为小麦，占比20%左右[3]。ZEN主要通过含ZEN的农作物或食用ZEN饲料的养殖动物，常见的如猪，牛等，对人体或动物产生各种生物毒性，如生殖毒性，细胞毒性，免疫毒性和肝肾毒性等，ZEN毒素可在胃肠道内长期持续吸收，持续滞留。
ZEN通过产生雌激素的作用，造成动物的急慢性中毒。以养殖猪为例，不同阶段的猪食用ZEN后，会造成不同的中毒症状，如成年母猪会产生不孕或假妊娠等现象，正常卵巢机能丧失，不排卵，怀孕母猪甚至发生流产、产子率低等情况；哺乳期母猪会产生乳汁减少，乳腺肿大增生等症状；小母猪则会出现早熟，不孕等症状，甚至引发死亡[4]。研究表明，在利用牛淋巴细胞为研究对象进行ZEN的毒性研究时发现，仅0.5 μmol/L的ZEN便可导致基因断裂，细胞死亡的现象；对实验小鼠喂食ZEN后导致小鼠肝脏肾脏功能衰竭，出现DNA加合物，同时造成生殖系统衰竭，产生不孕不育症状[5]。ZEN不仅危害动植物，对人体也会造成一定的损伤，如食用含赤霉病玉米的各种面食或误食食用ZEN的养殖动物，将对人体造成中枢神经系统的损害，出现中毒症状，如恶心，呕吐，发热，神志不清等症状[6]。研究表明，在食用受潮玉米小麦等地区，其癌症以及生殖功能衰退的发病率远高于其他地区，如伊朗地区北部患癌症的比例相对较高，青春期发育早熟现象较为普遍[7]。
为防控由于ZEN造成的中毒现象，根据我国《饲料卫生标准》规定，饲料中ZEN的最高限量为500ppb，玉米小麦中的ZEN限量标准为60 μg/kg[8]。同时常运用水浸、去皮、稀释或吸附法进行农产品或饲料的减毒去毒工作。
1.3 ZEN的检测方法
ZEN化学性质稳定，不易分解，目前ZEN的检测方法主要有两种，一种是色谱分析法，如气相色谱法（gas chromatography，GC），薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC），高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）等，另一种是免疫学法，如酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），免疫胶体金诊断法及生物传感器法等[8]。
1.3.1色谱法
薄层析法是由罗雪云等人建立的最早的检测方法，检测玉米小麦中的ZEN回收率了达80%以上，且其检测方法简单，成本低，因此选作为最初的国家检测方法，最低检出限为50 ng/g[9]。但由于检测样品提取过程复杂耗时，灵敏度不高的缺陷逐渐被其他检测方法替代。
对谷物产品如玉米小麦等粮食，常运用高效液相色谱法进行检测，其效果显著，检测结果稳定灵敏，且特异性高。李克[10]等利用该方法对玉米中的ZEN进行检测，最低检出限达3.7g/kg，在此基础上隋凯[11]等人建立了玉米小麦中ZEN的HPLC检测方法，ZEN含量在0.01-0.04 mg/kg的范围内具有良好线性关系，2003年，Saeger等人[12]又在荧光检测器的配合下，利用HPLC检测饲料中ZEN的含量，重复性较好，回收率高达92%-102%。但该方法不利于大量样品检测，仪器设备相对昂贵，检测时间长，样品的前处理过程复杂精细，衍生物或样品的浓缩精细，前处理对检测结果具有很大的影响，不适用于定点检测和高通量检测[12]。
1.3.2免疫法
免疫学检测方法是ZEN检测的发展趋势，检测灵敏度高，检测过程耗时较短，可以实现大量检测。利用ZEN的多克隆抗体进建立针对玉米和牛奶中ZEN的酶联免疫法，该方法对牛奶中的ZEN的检出限可达0.5 ng/mL，对玉米中ZEN的检出限可达0.05 ng/mL第二句有参考文献，不明白你指的哪里[13]。但该方法受环境的影响较大，如环境温度和操作条件等，同时有产生放射性污染的可能，抗体的特异性对检测结果影响较大，通常多克隆抗体会造成检测结果的误差较大，更适合于进行科学研究，而不适合在基层推广应用。
1.3.3 基于核酸适配体的检测法
核酸适配体是一种单链DNA或RNA配体，由1013-1016个核酸分子随机组合形成的核酸文库通过指数富集（SELEX）系统进化筛选产生，能够与靶标进行特异性结合，稳定且易制备，通常在4℃条件下能保存半年甚至更久，且其结构不会受到影响[14]。核酸适配体可以通过折叠形成不同的二级或三级结构，靶向识别金属离子、蛋白质、多肽、细菌病毒等各种分子，在结合力和特异性上与抗体类似，具有灵敏度高特异性强的特征，但在检测方法上又不同于抗体检测，具有更简便更快速的检测优势，目前已广泛应用于各类样品的检测[15]。
目前基于核酸适配体传感器主要有三种，分别为电化学传感器，光学传感器和共振传感器。电化学传感器主要借助于氧化还原探针在得失电子时产生电信号的原理实现对目标物的检测。在2005年实现了电化学传感器对凝血酶的检测，通过核酸适配体与凝血酶的特异性结合，导致核酸适配体构想变化，从而导致电信号的变化，这种微小的电信号可以灵敏的检测到6.4 nmol/L的凝血酶[16]。共振传感器是利用等离子共振的原理，通过光波的转变实现对物质的检测。利用共振传感器对腺苷的检测灵敏度高达0.1-10 μmol/L[17]。
光学传感器主要包含两种，荧光传感器和比色传感器。比色传感器相对简单，常用金纳米粒子作为比色探针，如Wang[18]等人利用金纳米和核酸适配体结合实现了对多巴胺的检测。而荧光传感器根据是否对适配体进行标记又分为两种，标记与非标记荧光传感器，Levy等人[19]首次将标记了量子点的适配体与标记淬灭物质的DNA杂交，实现标记型荧光传感器对凝血酶的检测，检出限达1nmol/L，且具有较高的特异性。用荧光稀土纳米颗粒作为标记物检测乙肝表面抗原（HBsAg），在310-360 nm紫外光激发下，其荧光成像检测限达0.2 ng/mL，既能进行单个样品的检测，又适用于大量样品的筛查[20]。而近几年对于非标记性荧光传感器的研究究受到广泛推崇，如利用核酸染料作为检测探针，利用其结合双链DNA产生荧光信号的原理，实现对靶标物质的快速检测，通过PicoGreen作为探针对玉米中ZEN的检测最低检出限能够达到0.1μg/L，且具有较高特异性[21]。基于DNA和溴化乙锭的新型非标记的荧光传感器实现了水溶液中的汞离子的检测，其检测，检出限达0.01 ppb，可用于快速检测饮用水是否汞超标[22]。
表1 各种检测方法对比图
Table 1 Compare of different detection methods
| 检测方法 | 前处理 | 检测设备 | 检出限 | 线性范围 | 回收率/% | 参考文献 |
| 薄层色谱法 |
研磨过滤 | 紫外灯检测 | 200 μg/kg | 500-20 000 μg/kg | 74-100 | [9] |
| 免疫亲和柱纯化 | 荧光检测器 | 10 μg/kg | 15-65 μg/kg | 95 | [9] | |
| 高效液相色谱及其联用技术 |
萃取，震荡过滤，磷酸盐缓冲液稀释 | 反向高效液相色谱荧光检测 | 5 μg/mL | 5-500 μg/mL | 90-118 | [10] |
| 石墨化炭黑固相萃取柱富集净化 | 超高效液相色谱串联质谱 | 0.1 μg/kg | 0.2-50 μg/kg | 82-103 | [11] | |
| 超声波辅助萃取 | 超高效液相色谱串联质谱 | 3.4 μg/kg | 15-750 μg/kg | 80-110 | [12] | |
| 绿洲HLB墨盒纯化 | 超高效液相色谱结合电喷雾离子化三四极串联质谱法 | 0.003-0.015 μg/kg | 0.01-1.00 μg/kg | 87-109 | [23] | |
| 酶联免疫吸附法 |
粉碎离心涡旋取上清 | 一步ELISA免疫法 | 80.5-96.2 μg/kg | 1-50 ng/mL | 80-108 | [24] |
| 研磨过筛萃取过滤 | 酶联免疫吸附分析 | 0.35 ng/mL | 0.54-7.99 ng/mL | 87-93 | [25] | |
| 均质震荡离心取上清 | ELISA试剂盒 | 93.5 μg/kg | 50-405 μg/L | 74.5-110 | [6] | |
| 免疫胶体金诊断技术 | 与抗体-胶体金孵育结合 | 荧光强度依赖毒素浓度 | 0.1 ng/mL | 0.1-1 000 ng/mL | 93-102 | [15] |
| 生物传感器法 |
甲醇-水萃取后用磷酸盐缓冲液稀释 | 基于毒素与抗体标记的量子点引起的荧光强度变化 | 4.1 μg/kg | 2.4 pg/mL-10 ng/mL | 84-110 | [16] |
| 啤酒样品60℃完全脱气 | 核酸适配体与ZEN结合引起的荧光强度变化 | 7.85×10-10 mol/L | 3.14 nmol-31.4 μmol/L | 85-105 | [17] |
2引言
ZEN是谷物产品中常见的真菌毒素污染，添加至饲料中会严重危害养殖动物，严重者造成动物死亡，人误食后也会造成神经系统的损坏。因此开发一种快速检测ZEN的方法对于防止ZEN中毒具有重要意义。由于Genefinder核酸染料具有结合双链DNA荧光显色的特性，当与双链DNA结合后荧光信号可显著增强[26]。Genefinder核酸染料是一种新型核酸染料，属于花青类染料，毒性很低，使用安全，可有效保护实验操作者和环境，具有安全、灵敏等突出优点[27]。常用于核酸电泳中的核酸染料，与双链DNA结合荧光信号可增强800—1000倍，最大发射波长在530 nm处，与该染料结合的核酸呈现绿色荧光[28]，在检测方面的研究较少。因此，本文以ZEN为研究对象，利用基于Genefinder核酸染料结合双链DNA会显著增强荧光的特性，结合适配体的特异性用于简单、高灵敏的检测食品中ZEN。
3材料与方法
3.1实验材料
初始浓度10000×的Genefinder核酸染料（厦门百维信公司），1μg/mL的玉米赤霉烯酮（Zearalenone ，ZEN）、赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)、黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）、黄曲霉毒素U1（AflatoxinU1,AFU1）T-2毒素（T-2 toxin，T-2）、黄曲霉毒素M1（AflatoxinM1，AFM1）六种真菌毒素（美国Sigma生物有限公司）溶于乙腈放在4℃冰箱中，10mM、pH7.4的PBS缓冲液，恒温水浴锅（北京生物仪器有限公司），恒温震荡混匀仪（提纳金一诺生物科技仪器有限公司）、超纯水仪、离心管、FL-2500荧光分光光度计（日本岛津公司）、Avanti J-301高速冷冻离心机（贝克曼库尔特公司）。ZEN核酸适配体及其互补链，由生工生物工程上海股份有限公司合成，序列信息如表2所示。
表2 ZEN核酸适配体及其互补链序列
Table 2 Sequence of ZEN aptamer and its complementary strand
| 核苷酸名称 | 序列（5’-3’） |
| ZEN核苷酸适配体 | TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG |
| 互补链 | TCAAATTAAAGATAATAATGTATTATAGAT |
3.2.1紫外最大吸收峰研究
在本方法中，用荧光分光光度计检测时需要确定激发波长，因此需要测出Genefinder染料的紫外最大吸收峰，从而帮助我们选择激发波长。用PBS缓冲液将Genefinder稀释至10×，震荡摇匀后，使用紫外分光光度计检测，得到Genefinder染料的紫外最大吸收峰。
3.2.2可行性分析实验
通过检测不同溶液的荧光响应情况以确定该方法以确定该方法是否可行。
(1)50nM适配体与Genefinder混合。取适配体（500 nM）50 μL加入1.5 mL离心管中，用PBS缓冲液稀释至498μL，震荡摇匀，再加入2 μL Genefinder核酸染料混合均匀，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
(2) 50nM互补链与Genefinder混合。取互补链（500 nM）50 μL加入1.5 mL离心管中，用PBS缓冲液稀释至498μL，震荡摇匀，再加入2 μL Genefinder核酸染料混合均匀，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
（3）40μg/L毒素。取20μL 1μg/mL的ZEN加入1.5 mL离心管中，用PBS缓冲液稀释至500μL，震荡摇匀，用荧光分光光度计在510 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
（4）50nM适配体与互补链混合。分别取适配体（500 nM）和互补链（500 nM）50 μl加入1.5 ml离心管中，用PBS缓冲液稀释至498μl，震荡摇匀，再加入2 μL Genefinder核酸染料混合均匀，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
（5）50nM适配体、50nM互补链和40μg/L毒素混合。分别取适配体（500 nM）和互补链（500 nM）50 μl加入1.5 ml离心管中，然后加入20μL 1μg/mL的ZEN， 用PBS缓冲液稀释至498μl, 震荡摇匀。水浴60min后，加入2 μL Genefinder核酸染料混合均匀，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
3.2.3 最佳孵育时间优化
取500 nM 适配体及互补链50μL，与20μL 1μg/mL的ZEN 混合后，用PBS缓冲液稀释至498μl，震荡摇匀。在35℃恒温水浴中分别孵育10 min、30 min、45 min、60 min、90 min，之后再加入2 μL Genefinder核酸染料，混合均匀，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
3.2.4 适配体用量的研究
适配体的用量在本方法中，体系的体积是确定的，为500μL，染料的用量也固定在2μL。因此适配体和互补链的用量是影响荧光强度变化率的重要因素。在ZEN的浓度一定时，适配体和互补链用量过多会导致荧光值变化率过低，不利于数据分析。
选适配体浓度分别为30 nM、50 nM、80 nM、100 nM、120 nM与相同浓度相同的互补链及20μL 1μg/mL的ZEN 混合，震荡摇匀。 35℃恒温水浴一段时间后，加入2 μL Genefinder核酸染料混合均匀，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
3.2.5 传感体系灵敏度研究
在探究一种新检测技术时，其灵敏度（又称最低检测限或敏感性）是一个重要参数。灵敏度对于该方法的实用性和价值都有着很大的影响。故本实验用100 nM适配体和相同浓度的互补链混匀，分别加入不同浓度的ZEN（0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L），震荡摇匀后置于35℃恒温水浴60 min，然后加入2 μL Genefinder核酸染料，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
3.2.6 特异性研究
在研究一个新方法时，其特异性也是影响其实用价值的重要因素。本文主要针对了食品和农作物中较为常见的几种真菌毒素，用来与ZEN作对比。
用100 nM适配体和相同浓度互补链混合均匀，加入同浓度的不同毒素（200μg/L T-2、OTA、ZEN、AFB1、AFM1、AFU1），混合均匀后放到35℃水浴60min，加入2μL Genefinder，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。
3.2.7实际样品检测
研究此方法的目的就是想要将其应用于实际检测中，故本文选用超市购买的玉米粉作实验材料，用本文构建的方法进行ZEN的含量检测。
(1)取5g玉米粉于20mL离心管中，用10mL乙腈水提取后，用离心机离心10min，过滤取其滤液，作对照组。
(2)取5g玉米粉于20mL离心管中，加入200μL 1μg/mL的 ZEN，用10mL乙腈水提取后，用离心机离心10min，过滤取其滤液，作实验组。
(3)用100 nM适配体和相同浓度互补链混合均匀，分别加入20μL对照组和实验组的滤液后，用PBS缓冲液稀释至498μL，震荡摇匀后35℃恒温水浴30min，加入2μL Genefinder，用荧光分光光度计在500 nm-650nm处检测扫描荧光光谱。利用本实验的方法测定ZEN的含量，计算加标回收率。
4结果与分析
4.1 实验原理
Genefinder是一种用于定量检测双链DNA的新型低毒甚至无毒的核酸染料，Genefinder能够与双链DNA结合产生强荧光。本研究构建基于Genefinder染料的荧光传感体系检测ZEN。检测原理图如图1，ZEN适配体与互补链结合形成双链DNA，Genefinder染料与双链结构DNA结合产生较强的荧光信号，加入ZEN后，适配体与ZEN结合，双链打开，荧光强度降低。根据荧光信号的变化实现对目标物ZEN的检测。
图1 ZEN检测原理图解
Fig1 ZEN detection principle diagram
4.2 Genefinder染料的紫外最大吸收峰
图2显示Genefinder染料的紫外吸收谱图，如图所示，Genefinder的最大吸收波长为503nm。一般的，染料的最大吸收波长为荧光的激发波长。因此，荧光光谱的激发波长设置为500nm。
图 2 Genefinder染料紫外光谱图
Fig2 Genefinder UV spectrum
4.3可行性实验分析
利用Genefinder检测ZEN时，首先要确定Genefinder与缓冲液，核酸适配体单链、互补链单链、以及核酸适配体与互补链形成的双链DNA是否会单独反应并释放荧光。检测结果如图3所示，通过对其进行实验可行性分析，由图可知，适配体与Genefinder作用后产生较弱的荧光（a）；互补链（b）与染料及单独的ZEN溶液（c）没有荧光信号；适配体与互补链结合后加入染料，荧光信号明显增强（d），这是因为适配体与互补链结合形成双链，染料与双链结合形成较强的荧光。加入毒素ZEN后，适配体识别ZEN，与其结合，双链打开，荧光强度降低（e）。因此，本研究建立的基于Genefinder核酸染料的检测方法可行。
图3不同溶液体系的荧光光谱图。（a）50nM适配体+Genefinder染料。（b）50nM 互补链 + Genefinder.（c）40μg/L ZEN（d）50nM适配体+50nM互补链+Genefinder染料。（e）50nM适配体+50nM互补链+Genefinder染料+40μg/L ZEN。（激发波长：500 nm；发射波长：530 nm）
Fig 3. Fluorescence spectra of different solution systems. (a) 50nM aptamer Genefinder. (b) 50 nM complementary strand + Genefinder. (c) 40μg/L ZEN +Genefinder . (d) 50 nM aptamer +50nM complementary chain + Genefinder. (e) 50 nM aptamer +50nM complementary chain + Genefinder + 40 μg/L ZEN. (excitation wavelength: 500 nm; emission wavelength: 530 nm)
4.2孵育时间优化
ZEN与适配体与互补链形成的双链DNA作用需要时间，若是孵育时间不够会导致双链打开程度不足，进而导致荧光强度不降低或降低幅度不明显；若是孵育时间太久则会增大时间成本。因此，研究本实验的最佳孵育时间，对于实验的准确性和控制时间成本具有重要意义。由图可知，当加入检测物反应后，荧光猝灭程度迅速增强，孵育时间60min后，荧光猝灭程度达到最大，这是因为适配体与ZEN结合达到饱和。因此实验获得最佳孵育时间为60 min。
图4孵育时间对荧光强度变化的影响（F：ZEN作用下的荧光值，F0：无ZEN的荧光值）
Fig 4. Effect of incubation time on the change of fluorescence intensity (F: Fluorescence intensity with ZEN, F0: Fluorescence intensity without ZEN )
4.3 适配体用量优化
为了进行高效高灵敏度的检测，需要选取适量的适配体进行反应，若适配体不足将导致不能与ZEN反应，从而无法准确检测ZEN含量，若适配体过量则导致不必要的实验消耗，同时影响实验结果。由图可知，随着核酸适配体浓度的增高，荧光猝灭量迅速增加，适配体浓度为100 nM时达到平衡。选用100nM的适配体用量继续实验。
图5 适配体浓度对荧光强度降低变化的影响（F：ZEN作用下的荧光值，F0：无ZEN的荧光值）
Fig. 5 Effect of aptamer concentration on the percentage decrease of fluorescence intensity (F: Fluorescence intensity with ZEN, F0: Fluorescence intensity without ZEN )
4.4 传感体系灵敏度研究
灵敏度是分析检测技术的重要参数，灵敏度越高检测准确性越高，灵敏度又称为最低检测限。真菌毒素在食品中的残留量通常较少，但仅微量的毒素便可存在较大的隐患，因此对于每种检测方法，其灵敏度指标是至关重要的，若最低检测限高于其产品合格最低含量，则造成检测结果无效的现象。本节在最佳实验条件下，研究了传感体系对不同浓度ZEN的荧光响应情况。由图可知，随着毒素ZEN浓度的增加，荧光信号逐渐减弱，说明当毒素与适配体结合后导致双链结构破坏，荧光强度降低。由图B显示，ZEN浓度在0.1-200μg/L范围内，1-F/F0与ZEN浓度的对数呈线性，其中F和F0分别表示ZEN作用下的荧光值、无ZEN作用下的荧光值，该传感体系实际可检测的检出限为0.1μg/L。结果表明该荧光传感体系具有较高的灵敏度。
图5 加入不同浓度ZEN时的荧光光谱图和其线性图
Fig5 Fluorescence spectrum and linear graph when adding different concentrations of ZEN
4.5 特异性研究
检测方法的特异性是检测方法开发过程中关键指标，是指检测方法是否仅能够特异性检测目标物。若检测产品中不同毒素之间的同源性较高，低特异性的检测方法则可能造成检测结果的不准确性，造成检测结果偏高的结果，因此通常设置交叉反应实验验证检测方法的特异性。本研究中选择OTA-2、OTA、AFB1、AFM1和AFU1为对照组。结果如图所示，ZEN造成较大的荧光猝灭量，因为传感体系中的识别元件——适配体与目标物ZEN可以特异性结合，与其他毒素无明显结合作用。
图6 传感体系的选择的（毒素浓度均为40μg / L）
Fig. 6 Selectivity of sensing system (toxins concentration: 40μg / L)
5 结论
ZEN是一种极易侵染谷物、饲料等产品的真菌毒素，威胁人畜健康，目前对于食品中ZEN的检测方法多样，但尚未有既灵敏又快速，又能同时检测多种样品的检测方法。因此开发一种快速而灵敏的ZEN检测方法对于有效避免ZEN危害具有重要意义。本文通过以上实验，构建了一种基于Genefinder核酸染料结合双链DNA能够荧光显色的特性检测ZEN的检测方法，利用Genefinder结合双链DNA产生荧光增强的特性，实现食品中ZEN的快速检测。通过进行紫外分光光度计可行性分析，优化最佳孵育时间，优化适配体与互补链用量以及最佳毒素检出浓度等，明确了该检测体系在530 nm处具有最佳检测峰，当孵育时间为60 min，适配体与互补链用量为100 ul时具有最佳检出效果，检出毒素最佳浓度为200 ug/kg，检出限为0.1-1000 ug/kg，通过对其进行特异性分析发现，不与其他毒素产生交叉反应，特异性较高。通过液相色谱法检测对比后发现，该方法与液相色谱法检测具有一致性。且当浓度处于10 μg/L时，回收率达到90%。因此可将该方法应用于市售玉米样品的检测，进行实际样品的检测。
目前国内市售农产品、畜牧饲料等产品中残留生物毒素、农药等问题仍旧存在，导致该现象的直接原因是没有一种高效快速的检测方法得以推广使用。而本文建立的基于Genefinder核酸染料适配体检测玉米赤霉烯酮的检测方法，相对于液相色谱检测方法、免疫法及气相色谱等常规检测方法，具有稳定性好、特异性强、灵敏度高、结果准确、易于判定的优势，具备快速、易操作、经济实用等优点，在现场大批量样品的快速检测中可以体现出其独特的优势，而且原理和方法十分简单，适合在基层推广应用，对于改善市售食品的ZEN污染具有重要意义，具有广阔的应用前景已增加一些内容，但结论不是讨论，没必要赘述吧，仅个人观点。
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